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“恒远生物”产品文献:补肾更年方对去除卵巢大鼠血清

点击次数:137 发布时间:2019/4/16
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补肾更年方对去除卵巢大鼠血清 E2 水平及下丘脑 ERα 蛋白表达的影响
张兰1 邰迎春1 王渊2 侯淑红1** 雷莉妍2

( 1. 陕西中医药大学附属医院,陕西 咸阳 712000; 2. 陕西中医药大学,陕西 咸阳 712046)
摘 要: 目的 治疗补肾更年方对去除卵巢大鼠血清 E2 水平和下丘脑 ERα 蛋白表达的影响,探讨其效应机制。方法 将 40 只大鼠用手术去除卵巢后随机分为补肾更年方大剂量组、中剂量组、小剂量组和己烯雌酚组,并与 10 只模型组和 10 只空白组做对照,补肾更年方大、中、小剂量组以不同剂量灌胃,模型组和空白组以生理盐水灌胃,己烯雌酚组以己烯雌酚按 1mL /100g 的剂量灌胃,连续 45  d,结束后,取血,放免法检测血清 E2 ,Western blot 法检测大鼠下丘脑 ERα 蛋白表达。结果 与空白组比较,模型组大鼠血清 E2 水平显著降低、下丘脑 ERα 蛋白表达显著减少( P < 0. 01) ; 与模型组比较,补肾更年方大、中剂量组和己烯雌酚组能够显著升高大鼠血清 E2水平并增加下丘脑 ERα 蛋白表达( P < 0. 05) ,补肾更年方小剂量组对其无明显影响( P > 0. 05) 。结论  补肾更年方在改善去除卵巢大鼠血清 E2 水平同时,可能通过影响 ERα 蛋白的表达,提高 ER 的生物效应,从而发挥对更年期综合征的治疗效应。
关键词: 去除卵巢大鼠; 补肾更年方; E2 ; ERα
中图分类号: R271. 11 + 2 文献标识码: A        文章编号: 1672 - 0571( 2018) 05 - 0112 - 05 DOI: 10. 13424 / j. cnki. mtcm. 2018. 05. 038
Effect of Bushen Gengnian Recipe on Serum E2 Level and Expression of ERα Protein in Hypothalamus of Ovariectomized Rats
Zhang Lan1 Tai Yingchun1 Wang Yuan2 Hou Shuhong1
( 1.  Affiliated Hospital of Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang China,712000;
2. Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang China,712046)
Abstract Objective: To treat the effect of Bushen Gengnian Recipe on serum E2 level and expres- sion of ERα protein in hypothalamus  of  ovariectomized  rats  and  to  investigate  its  mechanism.   Method: 40 rats were randomly divided into high - dose group,middle - dose group,low - dose group and dieth- ylstilbestrol group,and were  compared  with 10  model  groups  and 10  blank  groups.   The  high,middle and low dose groups were intragastrically administered with different doses of Bushen Gengnian Recipe. The model group and the blank group were intragastrically administered with normal saline.  The diethyl-

* 基金项目: 陕西中医药大学青年基金项目( 2015QN34) ; 陕西省教育厅科研项目( 16JK1222)
** 通讯作者: 侯淑红( 1978 - ) ,女,主管护师,研究方向: 中西医结合治疗sheng殖内分泌疾病的基础与临床研究。E - mail: 1362704055@ qq. com
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stilbestrol group was  administered  with  diethylstilbestrol  at  a  dose  of  1  mL /100  g.   after  45  days,the blood  was taken and the serum E2 was detected by radioimmunoassay.  The expression of ERα protein in the hypothalamus was detected by Western blot. Result:   Compared  with  the  blank  group,the  serum  E2 level of the model group was significantly decreased,and the expression of ERα protein in the hypothal- amus was significantly decreased ( P < 0. 01) .  Compared with the model group,The  high,middle  and low dose groups of Bushen Gengnian Recipe and diethylstilbestrol group could significantly increase the level of serum E2  in rats and increase the expression of ERα protein in the hypothalamus ( P < 0. 05) , while  the low - dose group of Bushen Gengnian Recipe had no obvious effect on it ( P > 0. 05) .  Conclu- sion: When improving serum E2 level in ovariectomized rats,Bushen Gengnian Recipe may increase the biological effects of ER by affecting the expression of ERα protein,thereby exerting therapeutic effects on menopausal syndrome.
Key words ovariectomized rats; Bushen Gengnian Recipe; E2; ERα

更年期综合征( menopausal  syndrome,MPS)  是一种以植物神经功能紊乱为主要表现伴有神经心理症状的妇科常见症候群,对妇女的工作、生活以及身心健康产生了较为严重的影响[1]。由于现代社会人们生活方式的改变、身心压力的与日俱增以及人口老龄化结构的形成,本病发病率逐年上升且发病年龄较以往提前[2 - 3]。中医学认为,肾虚为本病根本病机,有鉴于此,我们以滋阴降火为治法,自拟补肾更年方,在临床取得了良好疗效。本研究拟治疗补肾更年方对去除卵巢所致更年期综合征大鼠血清雌二醇( E2 ) 水平和下丘脑雌激素受体 α ( ERα) 蛋白表达的影响,以期进一步明确其作用机制。
1材料和方法
1. 1 药物与试剂 补肾更年方( 熟地黄 15  g,地骨皮 12  g,山药 10  g,知母 10  g,黄柏 10  g,白芍15  g,酸枣仁 15 g,yin羊藿 10 g,炙甘草 6 g) ,中药饮片由陕西中医中医药大学附属医院中药房提供; 己烯雌酚片( 规格: 0. 5  g / 片) ,天津力生制药股份有限公司,国药准字 H12020154; 兔抗鼠 ERα 蛋白抗体, 兔抗鼠 GAPDH 抗体,Santa Cruz 公司; E2  免疫试剂盒,上海恒远生物科技有限公司。
1. 2    实验动物     SD 大鼠,雌性,2 ~ 3 月龄,体质量 250 ± 20g,西安交通大学动物实验中心,动物合格证号: SCXK( 陕) 2016 - 015 号。
1. 3    主要仪器设备    离心机( 广州仪科实验室技术有限公司) ; 凝胶成像分析系统( BIO - RAD 公司) ,Image - proplus 6. 0 图像分析系统( Media  Cy-
bernetics 公司) ; γ - 911 全自动放免计数仪( 中国科技大学实业总公司) 。
1. 4 分组、模型组大鼠制备方法 将大鼠随机分为空白组、模型组、西药组、补肾更年方大剂量组、中剂量组、小剂量组共 6 组,每组 10 只。模型组大鼠即去除卵巢大鼠,采 用 10 % 水合氯醛,以300 mg / kg的剂量通过腹腔注射将大鼠麻醉后,将其进行仰卧位固定,对其下腹部进行备皮消毒,切  口部位定位于下腹部yin道口上方 2 cm 处,对此处进行正中切口,长度为 1cm,再将腹壁进行逐层切开,暴露双侧卵巢并在其下方进行结扎,将其切除, 用青霉素对此部位进行冲洗,最后将腹壁肌层和皮  肤连续缝合[4]。
1. 5    空白组大鼠制备方法    即假手术组,麻醉、体位、切口、消毒、缝合同模型大鼠制备方法,但不切除卵巢,而是将卵巢周围少量脂肪组织清除。
1. 6    各组干预方式    对于补肾更年方组,将补肾更年方各组成药物,煎煮浓缩成汤剂,大剂量组按
1. 5mL/100g、中 剂量组按  1mL/100g、小 剂量组按
0.5mL/100g,对大鼠进行灌胃; 对于西药组,将己烯雌酚片用蒸馏水制成含有己烯雌酚 0. 01  mg  / mL  的溶液,按1mL /100g 的剂量对大鼠进行灌胃; 对于空白组和模型组,均在每日同一时段进行同种程度抓取,采  用生理盐水,按 1mL/100g 的剂量对大鼠进行灌胃。上述6 组均进行每日1 次的干预,连续治疗45d。
1.7  指标检测方法  采用放免法检测大鼠血清E2 水平。采用免疫蛋白印迹( Western blot) 法检测大鼠下丘脑 ERα 蛋白表达,具体方法如下: 干预结

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束后,禁水禁食 24h,将大鼠麻醉,药物采用 10% 水合氯醛,快速取出大鼠下丘脑组织,将其放置于 EP 管中并投入于液氮中,取出后将标本放置于 - 80℃ 冰箱保存。Western blot 检测步骤: 将下丘脑样本按等量比例剪取,置于 EP 管,再于每份样本中加入 RIPA 蛋白裂解液,进行研磨、离心。每份样本的蛋白浓度应用 BCA 蛋白定量试剂盒给予测定, 上样和电泳目标蛋白,1h 后,对其转膜、封闭,加入一抗兔抗鼠 ERα( 1: 100) ,4℃ 孵育过夜,再将二抗
2
结果
2.1 各组大鼠血清 E2 水平
表 1 各组大鼠血清 E2 水平的比较( x ± s)
HRP - 羊抗兔 IgG( 1: 100) 加入其中,常温孵育 1h,
并洗涤、显影 5min,曝光目标蛋白,应用凝胶成像分析系统计算目标条带灰度值。
1.8    统计学方法     应用 SPSS19. 0 进行统计学处理,对于所有数据均以表示,采用单因素方差分析  ( One - way ANOVA ) 进行各组间均数的比较,采用最小显著差数( LSD) 法进行各组间均数的两两比较,以 P < 0. 05  作为评定差异有统计学意义的标准。
注: 与空白组比较,**P < 0. 01; 与模型组比较,#P < 0. 05。
对于大鼠血清 E2 水平,与空白组比较,模型组大鼠水平显著降低( P < 0. 01) ; 与模型组比较,大、中剂量组和西药组大鼠水平升高,具有统计学意义( P < 0. 05) ,小剂量组大鼠的水平没有显著性差异  ( P > 0. 05) ; 大剂量组与西药组大鼠比较,表达无显著性差异( P > 0. 05) ( 见表 1) 。
2.2 各组大鼠下丘脑 ERα 蛋白表达水平

图 1 各组大鼠下丘脑 ERα 表达的比较
表 2 各组大鼠下丘脑 ERα 蛋白表达的比较( x ± s)
组别 n 下丘脑 ERα( 比值)
空白组 10 46. 75 ± 4. 56
模型组 10 21. 03 ± 2. 73**
西药组 10 44. 32 ± 4. 17#
大剂量组 10 39. 11 ± 3. 52#
中剂量组 10 31. 32 ± 3. 08#
小剂量组 10 23. 29 ± 2. 89
注: 与空白组比较,**P < 0. 01; 与模型组比较,#P < 0. 05。
对于大鼠下丘脑 ERα 蛋白表达,与空白组比较,模型组大鼠表达显著降低( P < 0. 01) ; 与模型组比较,大、中剂量组和西药组大鼠表达升高,具有统计学意义( P < 0. 05) ,小剂量组大鼠的表达没有显著性差异( P > 0. 05) ; 大剂量组与西药组大鼠比较,表达无显著性差异( P > 0. 05) ( 见表 2,图 1) 。
3讨论
现代医学认为,MPS 的发病与神经内分泌免
疫调节机制的紊乱密切相关[5],临床上治疗本病以激素替代疗法为主,疗效尚不理想[6],因此,探 索其发病机理及安全、有效的治疗手段是亟待解 决的问题。中医学认为,肾虚是本病致病之本[7], 中药治疗本病疗效肯定,能够改善患者临床症状[8 - 9],并且可以发挥多靶点调节作用,如可延缓 卵巢功能衰退、调节内分泌水平和提高血中雌、孕 激素水平等 [10]。针对 MPS 以肾虚为本的病机[11],我们自拟补肾更年方,取得了良好的临床疗 效,为了进一步明确其效应机制,本研究拟治疗补 肾更年方对 MPS 大鼠血清 E2 水平和下丘脑 ERα 蛋白表达的影响。
中医认为,七七之年肾气渐亏,天癸将竭,阴 气衰半,自然出现阴虚现象,且易处于“阴常不足, 阳常有余”的状态,阴虚则火旺,火旺则阴更虚,故  在女性更年期时常易以阴虚火旺为主证,继而表 现出一系列相关症状,故我们以“滋阴降火”立法,
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自拟补肾更年方,方中熟地滋补肾阴,地骨皮清热 滋阴,两者相配合而为君,滋阴以治本,降火以治 标,使阴固而水能制火,热清则耗阴无由; 山药益气养阴,补肾固涩,知母滋阴润燥,清热泻火,两者 相配合而为臣,可滋肾阴,降虚火; 白芍养血调经, 酸枣仁养心安神,两者共具敛阴止汗之效,仙灵脾 调摄冲任,yin羊藿温肾助阳,两者相合寓阳中求阴 之意,四味相配合而为佐; 使药炙甘草甘缓和中、调和诸药。全方共凑补肾养阴降火、调补冲任 之效。
处于更年期的女性,卵巢功能逐渐衰退,卵泡 数量明显减少,sheng殖内分泌激素水平发生变化,雌 激素受体( ER) 减少,继而致使下丘脑及植物神经系统中枢功能失调,总体来说,下丘脑 - 垂体 - 卵巢性腺轴活动异常,是引起更年期代谢变化和临床症状的主要原因[12]。随着卵巢功能的衰退,雌  激素之一的 E2  分泌明显减少,雌激素受体的数量对雌激素发挥作用产生至关重要的影响,其中ERα 是维持正常的卵巢功能必不可少的雌激素受体,ERα 主要分布在中枢神经系统、子宫、心血管系统和骨组织中,其中下丘脑调节功能的异常是下丘脑 - 垂体 - 卵巢性腺轴紊乱过程的重要环节[13]。因此,研究补肾更年方对更年期大鼠血清  E2 水平和下丘脑 ERα 蛋白表达的影响,对于阐明下丘脑 - 垂体 - 卵巢性腺轴功能紊乱的机制有一定帮助,可为 MPS 的临床治疗提供一定实验依据。
研究结果表明,去除卵巢大鼠血清 E2  水平和下丘脑 ERα 蛋白表达量具有显著相关性,呈正相关态势( P < 0.  05) ,表明在 MPS 的形成过程中,两者共同参与其中,故升高 E2  水平和 ERα 蛋白表达,是治疗 MPS 的关键途径之一。对于大鼠血清E2 水平和下丘脑 ERα 蛋白表达,与空白组比较, 模型组显著降低( P  < 0. 05) ; 与模型组比较,补肾更年方大、中剂量组能够显升高 其表达( P <
0. 05) ,而小剂量组,干预效应不显现( P  > 0. 05) ;与模型组比较,西药组采用己烯雌酚灌胃,能够显著升高去除卵巢大鼠血清 E2 水平和下丘脑 ERα 蛋白表达,这与其他学者研究结果一致[14]。卵巢是雌性动物重要的sheng殖内分泌器官,主要与肾上腺皮质分泌雌激素 E2 。卵巢功能减退造成卵巢分泌雌激素水平下降,使正常的下丘脑 - 垂体 - 卵
巢轴之间平衡失调,本实验选择去卵巢的造模方法,切除双侧卵巢而人为制造卵巢功能突然减退的环境来模拟更年期综合征发生,结果模型雌性大鼠 E2 水平和下丘脑 ERα 蛋白表达降低,完全与更年期综合征的sheng殖内分泌情况完全一致[15]。研 究结果显示补肾更年方大、中剂量组和己烯雌酚一方面可能通过提高血清 E2 水平,改善去卵巢大鼠性激素水平,同时上调去卵巢大鼠下丘脑 ERα 蛋白的表达,使 ERα 合成增加,从而提高 ER 的生物效应,另一方面可能作用于子宫组织,改善子宫等组织营养,同时可作用于垂体、下丘脑或更高中枢,直接或间接地调节垂体促性腺机能,从而达到多环节调节sheng殖内分泌功能,综合发挥对更年期综合征的治疗作用。
综上,我们认为 E2 和 ERα 具有一定关联性, 可作为判断 MPS 发生、发展程度的关键生物标记, 这在预防和治疗 MPS  的过程中具有重要的意义。参考文献
[1]张玉珍. 中医妇科学[M]. 北京: 中国中医药出版社,
2005: 168.
[2]Zhou  Q,Tao  J,Song  H,et  al.   Chinese  herbal  medicine Kuntai capsule for treatment of menopausal syndrome: a systematic review of randomized  clinical  trials[J].   Com- plementary Therapies in Medicine,2016,29 ( 12 ) : 63
- 71.
[3]刘春梅. 围绝经期综合征的流行病学调查现状[J]. 中医药导报,2010,16( 4) : 115 - 117.
[4]石明晴,韩克. 补肾疏肝法调节去势大鼠血清 E2 水平及下丘脑 5 - HT 含量的机理研究[J]. 辽宁中医药大学学报,2012,14( 2) : 185 - 188.
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[6]曾春燕,叶云. 激素替代疗法治疗更年期综合征的研究进展[J]. 中国药房,2014,25( 18) : 1696 - 1699.
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[8] XY Wang,GN Nie,HY  Yang,et  al. Chinese  Medicine  for Menopausal Syndrome: Current Status,Problems and Strat- egies[J] . Chinese Journal of Integrative Medicine,2011, 17( 12) : 889 - 892.
[9]陈玉玲,张岩,曹玉凤. 中医药治疗更年期综合征新进展
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